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無需掃描! SPINDLE可實現3D高精度單分子定位成像▩•◕!

時間│▩✘:2022-07-25 點選次數│▩✘:86

無需掃描! SPINDLE可實現3D高精度單分子定位成像▩•◕!


介紹


超解析度顯微成像是一系列能夠使研究人員能夠“打破"光學顯微鏡衍射障礙的方法▩•◕·▩,在該系列方法中解析度高的技術為光啟用定位顯微技術(PALM)·╃。這些方法依賴於在數千幀中對單個分子的隨機子集進行定位(SMLM)▩•◕·▩,並將這些個體的定位重構為單個超解析度影象·╃。傳統的定位顯微鏡可以在橫向維度上進行10~20nm的精確成像▩•◕·▩,為了實現更高的定位精度▩•◕·▩,要求顯微鏡配置具有更高信噪比的靈敏探測器·╃。儘管橫向解析度令人印象深刻▩•◕·▩,但傳統的2D SMLM仍通常缺乏軸向解析度·╃。


美國Double Helix Optics公司的SPINDLER系列3D顯微鏡成像模組與3DTRAXR軟體相結合▩•◕·▩,可在三維尺度上實現高精度◕↟•、亞衍射極限定位▩•◕·▩,並具有擴充套件的深度成像能力·╃。SPINDLE採用精密光學器件設計▩•◕·▩,可與市面上在售的科學顯微鏡無縫整合▩•◕·▩,並提供qian 所wei 有的橫向和軸向精密成像組合·╃。使用者可根據具體的應用選擇合適的相位掩模版以實現基於深度範圍◕↟•、發射波長和信噪比等引數對點擴散函式(PSF)的最佳化▩•◕·▩,更重要的是▩•◕·▩,SPINDLE可在無需掃描的情況下在單張影象中將傳統成像系統的景深擴大10倍·╃。


在本文中▩•◕·▩,我們展示瞭如何將SPINDLE成像系統與傳統熒光顯微鏡結合使用以在所有三個維度(x◕↟•、y◕↟•、z)上實現亞衍射極限成像·╃。SPINDLE可與任何高質量的科學相機相容▩•◕·▩,無論是emccd還是scmos都可以提供定位顯微鏡所需的高信噪比影象·╃。


使用SPINDLE和DH-PSF相位掩模版對細胞微管進行三維超分辨成像


在本文中▩•◕·▩,我們證明了使用SPINDLE單通道模組可以實現高精度◕↟•、大深度的超解析度重建·╃。如圖1所示▩•◕·▩,使用Double Helix (DH-PSF) 的相位掩模版與SPINDLE單分子定位顯微鏡元件結合·╃。系統將單個分子發出的光分成兩個光瓣▩•◕·▩,透過找到兩個光瓣的中心來檢索發光點的橫向(x-y)位置;兩光瓣之間的角度編碼了發光點的軸向(z)位置·╃。這些額外的資訊將有助於在橫向和軸向尺寸上以非常高的精度(<20nm)進行超解析度重建·╃。此外▩•◕·▩,SPINDLE擴充套件了分子可以定位的景深▩•◕·▩,這種精確度和擴充套件深度成像的結合能夠以顯著提高的z軸解析度以收集更多的資料·╃。


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圖1│▩✘:基於單分子定位顯微成像技術(SMLM)技術的帶有可互換相位掩模支架的SPINDLE模組


為了演示SPINDLE的工作原理▩•◕·▩,我們使用NikonN-STORM顯微鏡結合Photometrics Prime 95B相機對被AlexaFluor 647偶聯微管蛋白抗體標記的Cos7細胞進行了成像·╃。對於該樣品▩•◕·▩,我們使用經過最佳化的相位掩模版▩•◕·▩,該掩模版可與遠紅外波長染料和1.49 NA的100倍物鏡配合使用·╃。樣品在640 nm鐳射連續照射下在Prime95B上成像▩•◕·▩,曝光時間為30 ms·╃。使用3DTRAX軟體對單發射點進行定位▩•◕·▩,並將結果匯出到ImageJ外掛Thun-der STORM·╃。使用歸一化高斯方法重建影象▩•◕·▩,並使用ImageJ查詢表“Spectrum"以顏色對z深度進行編碼·╃。


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圖2│▩✘:單個100nm珠在Prime95B上使用SPINDLE在焦平面(0µm)和焦平面上方(+1µm)和下方(-1µm)微米處的成像圖


重建的結果包含超過200萬個定位▩•◕·▩,並顯示Cos7細胞中微管的30µmx30µm視野◕↟•、深度超過2.1µm的範圍(圖3左)·╃。深度以顏色編碼▩•◕·▩,細胞底部為紅色/紫色▩•◕·▩,頂部附近為黃色/橙色·╃。放大的插圖顯示微管在一定深度範圍內得到了很好的重建(圖3▩•◕·▩,右)·╃。這些資料突出了使用Double Helix SPINDLE模組帶來的擴充套件景深成像和高橫向和軸向解析度·╃。


使用Double Helix 3DTRAX軟體進行高精度三維定位


Double Helix 3DTRAX軟體是一個ImageJ/FIJI外掛▩•◕·▩,其可以在橫向和軸向以亞衍射極限精度定位單個分子·╃。3DTRAX還使用克拉美-拉奧下限(CRLB)5計算了每個定位分子的精度值·╃。該計算基於每個定位的信噪比·╃。


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圖3│▩✘:使用SPINDLE(R)和Prime 95B成像的微管三維超解析度重建圖·╃。左圖│▩✘:Cos7細胞免疫染色的微管蛋白▩•◕·▩,顏色編碼深度·╃。右圖│▩✘:左側影象的放大區域▩•◕·▩,顯示了深度超過2微米的微管·╃。圖片由Double Helix Optics提供·╃。平均CRLB值橫向約10nm▩•◕·▩,軸向約20nm(圖3)


概括


Double Helix的SPINDLE超解析度3D顯微成像模組◕↟•、相位掩模和3DTRAX軟體的組合可實現高精度大深度三維成像◕↟•、跟蹤和計數·╃。在此應用中▩•◕·▩,我們在亞細胞結構的三維超解析度重建中展示了大約10nm的橫向精度和20nm的軸向精度·╃。SPINDLE系列產品為研究人員提供了強大的工具集▩•◕·▩,可促進對廣泛生物系統中分子結構◕↟•、亞細胞和細胞內相互作用的理解·╃。


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圖4│▩✘:橫向和軸向精度·╃。用於重建圖2所示影象的定位精度值·╃。精度值由3DTRAX軟體根據其信噪比使用每個發射器的Cramer-Rao下界5計算得出·╃。定位數顯示在y軸上▩•◕·▩,精度值(nm)顯示在x軸上


相關文獻;

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3.JainS,WheelerJR,WaltersRW,AgrawalA,BarsicA,ParkerR.ATPase-ModulatedStressGranulesContainaDiverseProteomeandSubstructure.Cell.2016;164(3):487-498.doi:10.1016/j.

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4.WangD,AgrawalA,PiestunR,SchwartzDK.Enhancedinformationcontentforthree-dimensionallocalizationandtrackingusingthedouble-helixpointspreadfunctionwithvariable-angleilluminationepifluorescencemicroscopy.ApplPhysLett.2017;110(21):211107.doi:10.1063/1.4984133.

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關於Double Helix Optics

美國Double Helix Optics是一家位於美國科羅拉多州博爾德的計算光學公司·╃。Double Helix Optics採用其zhuan利的雙螺旋光工程成像技術設計開發下一代高精度3D成像產品▩•◕·▩,廣泛應用在生命科學和材料科學領域以實現對亞細胞結構3D的成像◕↟•、跟蹤和計數·╃。

Double Helix的SPINDLE系列成像模組與可切換的相位掩模庫以及用於計算重建和分析的軟體相結合▩•◕·▩,確保為我們的客戶及其應用的具體情況提供高質量的3D成像技術·╃。


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